细胞凋亡测试步骤及注意事项

一、测试目的

1、掌屋不可逆转蛋白的构造相似性 2、研习用紫以外白光探针对蛋白进行双标示出来检测正常人来时蛋白、不可逆转蛋白和炎症蛋白的作法

二、测试数学模型

蛋白死亡根据其性质、起源及海洋生物学意涵区分为不可逆转和炎症两种不同类型。不可逆转值得忽略于灵魂两界，在海洋生物有机躯和生存中会起着非常极其重要的发挥作用。它是蛋白在一定生理前提下一系列顺序再次发生事件的复合，是蛋白遵循一定规律自己结束灵魂的自主操纵更进一步。蛋白不可逆转具有可辨认的构造学和海洋生物化学相似性。

在构造上可见不可逆转蛋白与周围蛋白复归认识，蛋白变园，蛋白膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩充、蛋白核子固缩破裂圆形团块状或新月状分布区、内质网和蛋白膜全面融合将蛋白分成多个完整袋中的不可逆转小躯，不可逆转小躯之后被吞噬蛋白吞噬消化。在不可逆转更进一步中会蛋白主旨物并不释放到蛋白以外，不会影响其它蛋白，因而不引起瘙痒反应。

在海洋生物化学上，多数蛋白不可逆转的更进一步中会，诱发小分子内切酶来时化，来时性增加。核子DNA随机地在核子小躯的连接肺脏被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核子DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的相似性。

相比之下，炎症是蛋白处于轻微破损前提下再次发生的蛋白死亡。蛋白在炎症早期即丧失质膜完整性，各种蛋白器膨胀，进而质膜瓦解释放成其中会的主旨物，引起瘙痒反应，炎症更进一步中会蛋白核子DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不会形成梯状带纹，而圆形弥散状。

一些平易近人的破损刺激及一些抗药物可正向蛋白不可逆转，通常这些因素在正向不可逆转的同时，也可产生蛋白炎症，这先取决于破损的轻微高度和蛋白本身对刺激的敏感高度。

索科利夫卡胺碱（HT）是今后自行仿制的一种对急性粒蛋白前列腺癌，急性内皮细胞前列腺癌等有较佳的抗药物。研究断定HT在0.02~5μg/ml区域内发挥作用2星期，即可正向HL-60蛋白不可逆转，并观感成典型的不可逆转相似性。本测试用1μg/ml HT在躯以外正向培养出来的HL-60蛋白再次发生不可逆转，同时也有少数蛋白再次发生炎症。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对蛋白进行双重漂白，可以分野不可逆转、炎症及正常人蛋白。

蛋白膜是一选择性的海洋生物膜，一般的海洋生物颜料如PI等不会穿过质膜。当蛋白炎症时，质膜不完整，PI就转回蛋白内部，它可嵌入到DNA或RNA中会，使炎症蛋白着色，不可逆转蛋白和来时蛋白不着色。而一些来时蛋白颜料由于为胺基酸杂质，可跨膜转回来时蛋白，因而可进行来时蛋白漂白。Hoechst33342是一种来时性紫以外白光颜料且危险性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍海洋生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示不可逆转蛋白和来时蛋白。凡是看到有不可逆转小躯的蛋白都是不可逆转蛋白。

三、测试用品

1、路易斯酸：索科利夫卡胺碱（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTAPH、中性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；丙酮；70%乙醇；溴酚蓝，烟草指示剂。TBE电泳PH，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。 2、医疗器械：紫以外白光白光学，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。

四、测试材料

人早幼粒前列腺癌HL-60蛋白，用含10%小牛血浆的RPMI1640培养出来基在37℃，5%CO2前提下培养出来。

五、作法步骤

1、索科利夫卡胺碱诱发HL-60蛋白不可逆转 （1）测试前约24星期，接种两瓶HL-60蛋白，标示出①、②，每瓶含约6ml培养出来液，置37℃，5%CO2培养出来箱培养出来。 （2）测试前约2.5星期，当蛋白密度达到70%，①号瓶转入索科利夫卡胺碱200μl，使终酸度为1μg/ml，②号瓶中会转入同等量PBS（pH7.4）作对照。协同抽成培养出来箱中会此后培养出来2.5星期。

2、Ho33342和PI双重漂白辨认三种蛋白 （1）漂白：将瓶中会的蛋白摇匀先取200μl于1.5ml的离心管中会，转入Ho33342母液2μl，PI 20μl，漂白15分钟。 （2）滴片：先取一载玻片用双面胶四周一四人，从离心管中会各先取以上漂白后的蛋白悬液10μl，转入四人内盖上盖玻片，紫以外白光镜下用紫以外激发白光，高倍镜下捕捉到，分野三种蛋白，并忽略三者比例。

六、忽略事项

1、正向培养出来HL-60蛋白时间要正确； 2、紫以外白光白光学下捕捉到蛋白时，由于紫以外白光坚硬灭掉，捕捉到时要须要更快。